酵母双杂交技术原理和步骤

2025-09-15 11:18:48 来源：网易用户：文咏力

【酵母双杂交技术原理和步骤】酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid, Y2H）是一种用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的分子生物学方法。该技术基于转录因子的结构特性，通过构建融合蛋白来检测两种蛋白质是否在细胞内发生相互作用。该方法广泛应用于功能基因组学、蛋白质互作网络的探索以及药物靶点筛选等领域。

一、技术原理

酵母双杂交系统的核心是利用酵母细胞中的转录因子，如GAL4。GAL4由两个结构域组成：DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）。当这两种结构域分别与不同的蛋白质融合后，若这两个蛋白质在细胞中发生相互作用，就能使BD和AD靠近并形成有活性的转录因子，从而激活报告基因的表达。

- DNA结合域（BD）：负责识别特定的DNA序列。

- 转录激活域（AD）：负责启动下游基因的转录。

- 报告基因：如LacZ、HIS3等，用于指示蛋白质间是否存在相互作用。

二、实验步骤

以下是酵母双杂交实验的基本流程：

步骤	内容说明
1. 构建载体	将目标蛋白基因与DNA结合域（BD）连接，构建“诱饵”载体；将另一蛋白基因与转录激活域（AD）连接，构建“猎物”载体。
2. 转化酵母菌株	将“诱饵”和“猎物”载体共转化到含有特定选择标记的酵母菌株中（如AH109或Y187）。
3. 筛选阳性克隆	在选择性培养基上筛选能够同时表达诱饵和猎物蛋白的酵母菌落。
4. 验证相互作用	通过报告基因的表达（如β-半乳糖苷酶活性检测、His3表达水平等）验证蛋白质是否发生相互作用。
5. 分离和鉴定蛋白	对阳性克隆进行测序，确定与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。

三、优缺点总结

优点	缺点
可在活细胞中检测蛋白质相互作用	依赖于酵母细胞内的环境，可能无法完全模拟体内条件
操作相对简便，成本较低	需要高质量的重组蛋白和合适的载体
适用于大规模筛选	可能存在假阳性或假阴性结果
可用于鉴定新蛋白相互作用	部分蛋白可能无法在酵母中正确折叠或表达

四、应用领域

- 蛋白质相互作用网络的构建

- 功能未知蛋白的初步功能分析

- 药物靶点筛选与验证

- 信号通路的研究

通过以上原理与步骤的系统介绍，可以看出酵母双杂交技术在蛋白质研究中的重要地位。尽管存在一定的局限性，但其仍是当前研究蛋白质相互作用的常用且有效的工具之一。

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